مروری بر تست cell free fetal DNA = cffDNA یا Non Invasive Prenatal Testing = NIPT جهت تشخیص اختلالات آنوپلوئیدی کروموزوم 21، 18 و 13

فلسفه استفاده از DNA آزاد موجود در گردش خون مادری با منشاء جنینی (cffDNA) از سال 1997 مطرح شده است. منشاء cffDNA از سلولهای تروفوبلاست جفت بوده و بدنبال پوسته ریزی سلولهای جفتی وارد گردش خون مادر می شود و 13- 3 درصد کل cell free maternal DNA مادر را تشکیل می دهد. در سه ماهه سوم بارداری این نسبت 10 الی 20% افزایش می یابد.
cffDNA در هفته 7 بارداری در خون مادر ظاهر شده و بلافاصله بعد از تولد از گردش خون وی پاک می شود، طوری که 2 ساعت پس از زایمان دیگر در خون مادر قابل تشخیص نمی باشد. از نظر سایز این مولکول خیلی کوچکتر از cell free maternal DNA بوده و سایزی در حدود 200-300 bp دارد و این خاصیت اساس بسیاری از تکنیکهای افتراق cffDNA از cell free maternal DNA را تشکیل می دهد.
البته بعضی از تکنیکهای قدیمتر از اختلافات موجود در نواحی اپی ژنیک cffDNA از cell free maternal DNA (مثل unmethylation index of the phosphodiesterases gene 9A و methylated DNA immunoprecipitation) استفاده می کنند. از آنجائیکه افتراق cffDNA از میان مقدار بالای cell free maternal DNA نیاز به تکنیک بسیار حساس و با دقت بالایی دارد بنابراین باید از تکنیک های بسیار پیشرفته که جهت آنالیز مولکولی مورد استفاده قرار می گیرد (مانند digital PCR و Massively Parallel Sequencing = MPS) برای تشخیص و جداسازی cffDNA استفاده کنند.

کاربرد cffDNA در زمینه های ذیل می باشد:
1- تشخیص non-compatible RhD factors
2- تشخیص sex determination for X-linked genetic disorders

سردسته این بیماریها عبارتند از: fragile X Syndrome، Duchenne muscular dystrophy، Hemophilia، بیماری Congenital Adrenal Hyperplasia (بدلیل مهار تولید کورتیکواستروئیدها هورمونهای آندروژن افزایش یافته و اگر جنین دختر باشد باعث مردانه شدن اندام تناسلی خارجی شده و در نتیجه باید از هفته 7 بارداری درمان با دگزامتازون را برای جنین های دختر شروع کرد و مانع از ترشح آندروژنها شد).
3- testing for single gene disorders
4- determining aneuploidies

– ارزش پیشگوئی کننده مثبت (Positive Predictive Value) تست cffDNA برای بررسی تریزومی 21، 5/45% در مقابل 2/4% تست های روتین غربالگری سه ماهه اول برای سندرم داون می باشد. این میزان در تریزومی 18، 0/40% در مقابل 3/8% تست های روتین غربالگری سه ماهه اول می باشد. در مطالعه دکتر Lewis در سال 2014 مشخص گردید که میزان مثبت کاذب برای سندرم داون یا تریزومی 21، 3/0% در مقابل 6/3% تست های روتین غربالگری سه ماهه اول و برای سندرم ادوارد یا تریزومی 18، 2/0% در مقابل 6/0% تست های روتین غربالگری سه ماهه اول می باشد.

طبق توصیه دسامبر 2012 ACOG و انجمن طب مادر و جنین در مورد تست cffDNA، باید به نکات ذیل توجه نمود:
–  تست Cell Free Fetal DNA تشخیصی نبوده و جایگزین CVS و آمنیوسنتز نمی باشد.
–  قدرت تشخیص این تست برای تریزومی ۲۱، ٪۹۸ است (مثبت کاذب کمتر از ۰/۵ درصد). توجه: در مطالعات مختلف گزارشات بسیار متناقضی از قدرت تشخیص تست ارائه شده است بطور مثال در مطالعه دکتر لیم و همکاران در سال 2011 قدرت تشخیص 3/83% (15 مورد از 18 مورد داون تشخیص داده شد)، در مطالعه دکتر پالوماکی و همکاران در سال 2011 قدرت تشخیص 6/98% (209 مورد از 212 مورد داون تشخیص داده شد)، در مطالعه دکتر دنگ و همکاران در سال 2011 قدرت تشخیص 8/95% (23 مورد از 24 مورد داون تشخیص داده شد) و در مطالعه دکتر دان و همکاران در سال 2012 قدرت تشخیص 100% (139 مورد از 139 مورد داون تشخیص داده شد) گزارش شده است.
–  قدرت تشخیص آن برای تریزومی 18، 98-97% و برای تریزومی 13، 80-79% می باشد (مثبت کاذب کمتر از 1 درصد).
–  بیمار با یک تست مثبت باید برای مشاوره ژنتیک و انجام تست های تشخیصی جهت تائید نتیجه این تست ارجاع داده شود. 
–  یک نتیجه منفی به معنی اطمینان کامل از سلامت جنین از نظر سندرم داون نیست.
–  این تست باید صرفأ به گروه‌های زیر توصیه شود:
–  زنان 35 سال یا بالاتر
–  وجود یک تست غربالگری مثبت ازجمله تست های غربالگری سه ماهه اول، دوم، اینتگریتد و یا سکوئنشیال
–  یافته سونوگرافیکی که نشان دهنده افزایش ریسک اختلالات آنوپلوئیدی می باشد.
–  وجود سابقه قبلی برای وجود تریزومی ها
–  وجود یک Parental balanced robertsonian translocation که سبب افزایش ریسک تریزومی 13 و 21 در جنین می شود.
–  این تست نباید به گروه کم خطر و یا زنان باردار دو قلو به بالا پیشنهاد شود چرا که این تست به اندازه کافی در این دو گروه مورد ارزیابی قرار نگرفته است.
–  این تست قادر به تشخیص فرمهای موزائیسم، partial chromosome aneuploidy، ترانسولوکیشن و یا آنوپلوئیدی های مادری نمی باشد.
–  اگر یک آنومالی ساختاری در سونوگرافی جنین مشاهده شود باید بیمار مستقیماٌ برای انجام تست های تهاجمی تشخیصی ارجاع داده شود.

قبل از انجام تست باید سابقه خانوادگی گرفته شود تا مشخص شود آیا نیاز به انجام سایر تست های غربالگری و یا تشخیصی است یا خیر.

دکتر مارک لیچ در سال 2013 گزارش نمود که در واقع DNA که در این روش مورد بررسی قرار می گیرد DNA جنین نبوده بلکه DNA جفتی می باشد.
بر اساس یافته های علم جنین شناسی گامت (تخم) تشکیل شده ، در عرض ۲ ‌روز پس از لقاح و تشکیل تخم، تخم سفر خود را از طریق لوله رحمی به سمت رحم آغاز می کنند که این امر با فعالیت عضلات جدار لوله میسر می شود. 

در همین زمان، تخم خود را مکرراً‌ تقسیم می کند تا مجموعه ای از سلول ها (بلاستومرها) به نام مورولا حاصل شود.

تقسیم سلول های در حال عبور از لوله حمل تخمک ادامه یافته بطوریکه تعداد آنها هر ۱۲ ‌ساعت دو برابر می شود. وقتی مجموعه سلولی فوق به رحم می رسد، شامل صدها سلول است. 

پس از 6 ‌تا 12 ‌روز (متوسط 9 روز) این مجموعه سلول به رحم می رسد و در لایة آندومتر لانه‌گزینی آغاز و شروع به تقسیم سلولی می‌کند در اولین تقسیمات سلولی یک سری سلول‌های متفاوت که در آینده عملکرد مختلفی دارند تشکیل می‌شوند:

1- یک سری سلولها جنین را تشکیل می دهد.

2- یک سری سلولها در آینده جفت را تشکیل داده و به آن سیتوتروفوبلاست (Cytotrophoblast) می گویند.

3- یک سری سلولها هم به صورت یک لنگر باعث اتصال جنین و جفت به جدار رحمی مادر می شود که به آن سلولهای سن سیتیوتروفوبلاست (Syncytiotrophoblast) می گویند.

بنابراین در واقع تقریبأ تمام cffDNA که در خون مادر دیده می شود، در واقع منشاء آن از سلولهای جفت بوده و نه جنین و بهتر است به آن cell free placental DNA بگوئیم.

بنابراین در مواقعی که موزائیسم جفتی وجود دارد ( confined placental mosaicism زمانی ایجاد می شود که سه تایی شدن کروموزوم در بعضی سلولهای تشکیل دهنده جفت دیده می شود، در حالیکه سلولهای دیگر از جمله سلولهای جنین نرمال بوده) به همین علت می تواند ایجاد مثبت کاذب نماید (درست مانند مشکلی که در CVS دیده می شود و در نتیجه برای تأئید تشخیص نیاز به آمنیوسنتز داریم).

این وضعیت در 2-1% بارداری ها دیده می شود و در نتیجه وضعیت تقریبأ شایعی است.

هرچند cffDNA ممکن است متمایز از cell free placental DNA باشد اما در قسمت اعظم موارد، صحت نتایج آن بسیار خوب است، در حالیکه توجه به تفاوت مفهومی بین این دو اصطلاح ضروری است. به همین دلیل است که این تست هرچند صحت بالایی دارد ولی قدرت کافی برای تصمیم گیری بدون انجام تست های تشخیصی مثل آمنیوسنتز را ندارد.

دکتر کاگان و همکاران در سال 2014 توصیه نمودند ترکیب تست غربالگری سه ماهه اول و NIPT با هم قدرت تشخیص 97% و مثبت کاذب 1% برای اختلالات کروموزومی بدست می دهد. از این تست برای تعیین جنسیت و بررسی اختلالات کروموزومهای جنسی (مثل سندرم ترنر، کلاین فلتر و …) هم استفاده می شود هرچند مستلزم صرف هزینه بیشتر بوده و در ضمن قدرت تشخیص آن برای کروموزومهای جنسی هنوز نیاز دارد که ارزیابی بیشتری در مورد آن انجام شود.

دکتر اوانس و همکاران در سال 2014، گزارش نمودند که در استراتژی انجام تست cffDNA برای تمام زنان باردار برای هر بیمار بسیار گرانتر (حدود 1017 دلار) از روش انجام غربالگری سه ماهه اول و سپس انجام cffDNA برای گروه پرخطر می باشد که به آن روش مرحله به مرحله یا contingent (حدود 409 دلار). به عبارت دیگر هزینه حاشیه ای برای تشخیص یک مورد سندرم داون در استراتژی انجام تست cffDNA برای تمام زنان باردار حدود 3 الی 16 برابر بیشتر از روش های مرحله به مرحله می باشد.

دکتر کلارک گاناهارت و همکاران در سال 2014، دو مورد از موارد مثبت کاذب این تست را گزارش نمودند: یک مورد تست از نظر تریزومی 18 مثبت شد در حالیکه نشان دهنده فرم موزائیسم تریزومی 18 در جفت بوده و جنین سالم بوده و یک مورد از نظر تریزومی 13 مثبت شد ولی در آمنیوسنتز کروموزوم 8p duplication/deletion بدست آمد.

موارد مثبت کاذب تست NIPT:

منظور این است که تست NIPT مثبت شده است در حالیکه در آمنیوسنتز مشخص می شود که جنین سالم است که علت آن می تواند:

1-  Confined Placental Mosaisims 

(این حالت زمانی ایجاد می‌شود که سه‌تایی شدن کروموزوم در بعضی سلول‌های تشکیل دهندة جفت دیده می‌شود، در حالی که سلول‌های دیگر از جمله سلول‌های جنین نرمال می‌باشند، این حالت در 2-1% بارداری‌ها دیده می‌شود و در نتیجه وضعیتی تقریباً شایع است. شبیه مشکلی که در CVS دیده می‌شود و در نتیجه برای تأئید تشخیص نیاز به آمنیوسنتز داریم)

2- Vanishing twins  : وجود یک قل تحلیل رفته که باعث آزاد شدن کروموزوم های اضافی می شود (حداقل فاصله بین خونگیری و مرگ قل دوم باید 8 هفته باشد)

3- Maternal Malignancy  (maternal copy number variation = CNV): بدلیل وجود یک سری کپی نامبرهای غیرطبیعی مترشحه از سلولهای توموری که به آن maternal copy number variation = CNV می گویند

4- از علل دیگر مثبت کاذب مواردی مثل:

– تزریق خون طی 12 ماه گذشته 
– پیوند مغز استخوان  

بطور کلی هر موقع منشائ سومی از کروموزوم ها وجود داشته باشد می تواند در نیتجه تست تاثیر بگذارد.

موارد منفی کاذب تست NIPT:

 – –  جنین تریپلوئید: بدلیل آنکه تمام کروموزوم ها سه تا شده اند این تست در هنگام محاسبه نسبت کروموزوم 21 به کروموزوم های پایه این نسبت را 1 به 1 محاسبه و بعنوان جنین سالم گزارش می کند.

 – –  موزائیسم واقعی جنینی (true fetal mosaicism): در این موارد بعضی از بافت های جنین به صورت موزائیسم شامل سلولهای نرمال و هم آنوپلوئید می باشد در حالیکه جفت سالم است ( which a mosaic cell line was absent in cytotrophoblast and present in the fetus).

میزان بروز این پدیده 1:107 می باشد.

موادری که منجر به عدم جواب (not reported) در تست NIPT  می شود:

–  اگر تست قبل از هفته دهم حاملگی انجام شود امکان کسب نتیجه منفی کاذب به دلیل کاهش fetal fraction وجود دارد. 

– بعضی از ترکیبات ضد انعقادی (نظیر Enoxaparin، آسپرین و یا هپارین) با کاهش سطح Fetal Fraction باعث عدم نتیجه در تست NIPT می شود.

هر چند مکانیسم این عمل مشخص نیست ولی از آنجائیکه فرآیند آپوپتوزیز در پوسته ریزی سلولهای جفت به خون مادر نقش دارد، ترکیبات ضد انعقادی از طریق کاهش فرآیند ترومبوز جفتی، کاهش هایپوکسیا و کاهش التهاب در ناحیه جفت باعث کاهش فرآیند آپوپتوزیز می شود.

–  اگر برای زنان بسیار چاق انجام شود امکان کسب نتیجه منفی کاذب وجود دارد (وزن بالای 250 پوند و یا 113.4 کیلوگرم در 10% موارد منجر به کاهش fetal fraction به کمتر از 4% می شود).

–  فاکتور رقت (Dilution effect)  

–  بالا بودن adipocyte turnover در زنان چاق که سبب افزایش فرآیند دژنره شدنcfDNA  می شود.

–  از آنجائیکه شیوع اختلالات کروموزومی در گروهی از بیماران که عدد NT آنها در سونوگرافی غربالگری سه ماهه اولی در محدوده 95 تا 99 پرسنتایل می باشد، بین 3.5 تا 3.7% است، بنابراین کاندید انجام NIPT برای بررسی بیشتر اختلالات کروموزومی می باشند.

– تست NIPT نسبت به سایر تست های غربالگری این مزایا را دارد:

– –  مثبت کاذب کمتر: احتمال مثبت کاذب این تست زیر یک درصد برای تریزومی های 21، 18 و 13 است.   

– – قدرت تشخیص بالاتر: بدلیل تفکیک DNA آزاد موجود در گردش خون مادری با منشاء جنینی (cffDNA) از DNA آزاد با منشاء مادری (cfmDNA) که در این روش انجام می گیرد، قدرت تشخیص به بالای 99 درصد برای اختلالات کروموزوم های 21، 18 و 13 می رسد.

– –  صحت بالای تعیین جنسیت: قدرت تشخیص جنسیت در این روش بالای 97% است که نسبت به بسیاری از تست های مشابه خود بالاتر است.

– –  عدم وجود احتمال سقط جنین: بر خلاف روش های تشخیصی تهاجمی، به دلیل آنکه این تست فقط بر روی خون مادر انجام می شود، ریسکی برای ایجاد سقط جنین ندارد.

– –  عدم تاثیر پذیری از بارداری های قبلی: از آنجائیکه نیمه عمر cffDNA کمتر از 2 ساعت است بنابراین بارداری های قبلی اختلالی در نتیجه تست ایجاد نمی کند.

– –  تشخیص زود هنگام: این تست از هفته 10 بارداری قابل انجام است.

– – جوابدهی سریع: جواب بین 3 تا 7 روز کاری بعد از نمونه گیری آماده می شود.

– – بهترین پروتکل غربالگری بعد از هفته 22 بارداری

گروه پرخطری که در غربالگری سه ماهه اول کاندید NIPT می شوند:

طبق پروتکل کشوری افرادیکه ریسک تست های غربالگری شان در محدوده پر خطر قرار گرفته است ، کاندید تست های تشخیصی هستند.

در موارد ذیل می توان به این گروه از افراد به جای تست های تشخیصی توصیه به انجام NIPT:

 – زنانی که وحشت زیادی از نمونه گیری تستهای تشخیصی مثل آمنیوسنتز و یا CVS دارند،

– زنانی که زیر بار ریسک سقط تست های تشخیصی نمی روند،

– زنانی که سابقه سقط مکرر دارند، به شرط آنکه کاریوتایپ پدر و مادر نرمال باشد (علت سقط مکرر اختلالات کروموزومی نباشد)،

– زنانی که خونریزی واژینال دارند (تهدید به سقط هستند)،

– زنانی که Rh  منفی هستند،

 –  زنانی که HIV و یا HCV مثبت هستند،

– زنانی که Hbe Ag مثبت دارند و یا HBV viral load > 1,000,000 copies/ml

 – زنانی که جفت پایین دارند،

– زنانی که مالتیپل فیبروما دارند،

– زنانی که سابقه پارگی کیسه آب (PROM) دارند،

– مواردی که کشت آمنیوسیتها موفقیت آمیز نمی باشد،

– مواردی که با یک جنین طلایی مواجه شده ایم.

– جنینی که بعد از چندین سال ناباروری حاصل شده است، 

– جنینی که از والدین با سن خیلی بالا حاصل شده است،

– جنینی که حاصل  ART (Artificial Reproductive Technology) مثل IVF و یا ICSI  می باشد.